結合miRTarBase與RNA 22的資料庫尋找miRNA的target sites

• 這個禮拜林老師教的資料庫分析是利用miRTarBase與RNA 22的資料庫，找出我們有興趣的miRNA於調節target gene的binding sites。
• miRTarBase的網址: http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/
• RNA 22的網址: https://cm.jefferson.edu/rna22v2.0/

Step1. 進入miRTarBase的首頁，輸入有興趣的hsa-miRNA18a-5p做搜尋。

Step2. 點選"search"的選項後會出現predict的miRNA target genes，在列出來眾多的target genes中我選擇ATM來做分析。且ATM基因與miRNA-18a 5p的evidence較為完整。



Step3. 另一方面，進入RNA 22的首頁，點選以下紅線框選的網址"Pre-computed Predictions"。接著點選"HOMO SAPIENS"的選項。



Step4. 在欄位最下面的What輸入基因名稱"ATM"，submit後會出現cDNA map。

Step5. 點選"View Predictions as cDNA map"，會出現ATM基因的cDNA序列，在序列右方有欄位選項為"Choose location/miR"，此欄位是表示出在ATM cDNA序列上可能會與之作interaction的miRNA。
我們想要比對的是hsa-miRNA18a-5p於ATM基因上的biniding sites，所以我們直接點選"Expert predictions as Tables (new)"

Step6.  接著此用Ctrl+F 於搜尋欄位輸入18a-5p，會找到以下ATM基因上有7個位置可能會被hsa-miRNA-5p所辨識。將可能的binding sites記錄下來後，再回到上一頁的cDNA map。

Step7.  將上一步所記錄下來的位點進行搜尋，如以下綠色箭頭表示為此位置沒有miRNA18a-5p的binding sites，因為miRNA主要binding的位置是在CDS(coding regions)的前面，故在cDNA map上不能在有CDS的位置上點選。
而紅色箭頭的部分為我找到的binding sites，因此結論為在ATM基因之cDNA的序列上，在9798與10416的位點可能是hsa-miRNA18a-5p調節ATM基因所結合的位置。

Step8. 最後補充一下文獻搜尋的部分:在2013年2月的Molecular Medicine Reports已經有證實ATM會受到miR-18a的調控。

VMD於研究蛋白的應用

上個禮拜梁博士教的軟體是VMD(Visual molecular dynamics)，中文是視覺分子動力軟體。VMD的優點是利用3D繪圖和內建資料庫，可針對大型二分子系統提供顯示、動畫和分析功能。以下會利用VMD的軟體來建構一個被水分子包圍的蛋白質分子。

Step1. 首先，在RCSB Protein data bank的網站上搜尋一個想要分析的蛋白質分子。我的研究主題跟幽門桿菌的CsrA蛋白相關，但是在幽門桿菌的部分CsrA蛋白尚未被解出3D結構，所以我選擇homology相似的E.coli 的CsrA蛋白來做VMD的應用。

Step2.  E.coli 的CsrA蛋白在PDB的代號是1Y00，接著下載其結構格式為PDB files。

Step3. 將事先下載好的VMD軟體打開，點選File > New Molecular>Browse(點選在PDB下載的file: 1Y00) > Load。此時軟體會display CsrA蛋白的3D結構。

Step4. 一開始可以更改display的方式，先點選Graphics > Representations > 將drawing method改為NewCartoon > Apply。

Step5. 點選Extensions > Modeling > Automatic PSF Builder > Load input files > Guess and split chains using current selections > I 'm feeling lucky 。接著會跑出1Y00_autopsf.psf的file。

Step6.  點選Extensions > modeling > Add Solvation Box > 打勾Rotate to minimize volume的選項 > Box Padding 設定Min: X=5, Y=5, Z=5 ；Max: X=15, Y=15, Z=15 > Solvate 。接著會跑出solvate.psf的file。在display的3D圖形中可以看到CsrA蛋白分子周圍被水分子包圍形成像box的分子模型。

Step7.  點選Extensions > Modeling > Add Ions > Iron placement mode的預先設定是使用NaCl做neutralize > Autoionize 。接著會出現ionized.psf的file 。

使用VMD的軟體經過以上步驟就可以完成在蛋白質分子的周圍加上水分子的應用囉!!!!!

RSCB data bank and PyMol

1.這禮拜王老師介紹的網站是RCSB protien data bank以及PyMol軟體的使用。

RCSB data bank可以幫助我們了解蛋白質的組成和立體結構。

2.在PDB statisitcs的統治資料中，可以看到目前已經有105025個protien被解出結構了!!!!!!不管是NMR或是X-ray等的方法都有統計數據。

3.在我的研究中，主要研究的是幽門桿菌H. pylori的碳源調節蛋白(Carbon storage regulatorA)，因為在HP的文獻中還沒有被解出CsrA的結構報導，所以我找了E. coli的CsrA來看結構，目前E. coli於CsrA的研究也是最完整的。E.coli的結構代號是1Y00。

4.到PyMol的網站下載PyMol的軟體，並且輸入1Y00的代號就會跑出CsrA的結構。可以使用設定更改結構為卡通圖和換顏色，更好用的功能是可以輸入胺基酸序列找出在立體結構中相對影的位置。(P.S.動畫代補)

Build a tree

1.這次老師教的軟體是先利用Bioedit先編輯與align不同species的sequence，之後再用phylip-3.69去做親緣關係的比對並劃出生物樹，可以用來比較不同物種之間的關係。以下是流程圖：

2.首先先開啟Bioedit的程式，接著匯入老師給我們當範本的SEQ1~10的檔案。

3.點選Accessory Application"  >  "ClustalW Multiple Alignment，執行後會將10個不同的sequence進行align的比對，並排列出順序。

4.將序列存檔成"phylip"格式的檔案，儲存在exe的資料夾裡面。

5.用記事本打開檔案，可以看到序列會依照整理過後的方式排列。下次建tree時可以打開此檔案。

6.在exe的資料夾中選擇seboot的軟體，打開剛剛儲存infile的檔案匯入，操作如下:

操作完回得到一個outfile，要改成infile-1才可以繼續往下操作。

7.接著一樣在exe的資料夾中找到protdist的軟體，匯入剛剛改成infile-1的檔案，操作如下:操作完成後一樣會得到一個outfile的檔案，再改成infile-2往下操作。

8.在exe的資料夾中打開neighbor的軟體匯入剛剛infile-2的檔案，操作完後會得到兩個檔案:oufile和outtree。把outtree改成intree，快完成樹囉~~~~~!!!!!

9.在exe的資料夾中找到consense的軟體匯入intree的檔案，就出現最後最後的outtree囉~~~~

10.打開treeview的軟體匯入剛剛outtree的檔案，如此一來tree就完成了!!!!!!可以比較這十個amino acid sequence的親緣性了~~~