結合miRTarBase與RNA 22的資料庫尋找miRNA的target sites

• 這個禮拜林老師教的資料庫分析是利用miRTarBase與RNA 22的資料庫，找出我們有興趣的miRNA於調節target gene的binding sites。
• miRTarBase的網址: http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/
• RNA 22的網址: https://cm.jefferson.edu/rna22v2.0/

Step1. 進入miRTarBase的首頁，輸入有興趣的hsa-miRNA18a-5p做搜尋。

Step2. 點選"search"的選項後會出現predict的miRNA target genes，在列出來眾多的target genes中我選擇ATM來做分析。且ATM基因與miRNA-18a 5p的evidence較為完整。



Step3. 另一方面，進入RNA 22的首頁，點選以下紅線框選的網址"Pre-computed Predictions"。接著點選"HOMO SAPIENS"的選項。



Step4. 在欄位最下面的What輸入基因名稱"ATM"，submit後會出現cDNA map。

Step5. 點選"View Predictions as cDNA map"，會出現ATM基因的cDNA序列，在序列右方有欄位選項為"Choose location/miR"，此欄位是表示出在ATM cDNA序列上可能會與之作interaction的miRNA。
我們想要比對的是hsa-miRNA18a-5p於ATM基因上的biniding sites，所以我們直接點選"Expert predictions as Tables (new)"

Step6.  接著此用Ctrl+F 於搜尋欄位輸入18a-5p，會找到以下ATM基因上有7個位置可能會被hsa-miRNA-5p所辨識。將可能的binding sites記錄下來後，再回到上一頁的cDNA map。

Step7.  將上一步所記錄下來的位點進行搜尋，如以下綠色箭頭表示為此位置沒有miRNA18a-5p的binding sites，因為miRNA主要binding的位置是在CDS(coding regions)的前面，故在cDNA map上不能在有CDS的位置上點選。
而紅色箭頭的部分為我找到的binding sites，因此結論為在ATM基因之cDNA的序列上，在9798與10416的位點可能是hsa-miRNA18a-5p調節ATM基因所結合的位置。

Step8. 最後補充一下文獻搜尋的部分:在2013年2月的Molecular Medicine Reports已經有證實ATM會受到miR-18a的調控。

VMD於研究蛋白的應用

上個禮拜梁博士教的軟體是VMD(Visual molecular dynamics)，中文是視覺分子動力軟體。VMD的優點是利用3D繪圖和內建資料庫，可針對大型二分子系統提供顯示、動畫和分析功能。以下會利用VMD的軟體來建構一個被水分子包圍的蛋白質分子。

Step1. 首先，在RCSB Protein data bank的網站上搜尋一個想要分析的蛋白質分子。我的研究主題跟幽門桿菌的CsrA蛋白相關，但是在幽門桿菌的部分CsrA蛋白尚未被解出3D結構，所以我選擇homology相似的E.coli 的CsrA蛋白來做VMD的應用。

Step2.  E.coli 的CsrA蛋白在PDB的代號是1Y00，接著下載其結構格式為PDB files。

Step3. 將事先下載好的VMD軟體打開，點選File > New Molecular>Browse(點選在PDB下載的file: 1Y00) > Load。此時軟體會display CsrA蛋白的3D結構。

Step4. 一開始可以更改display的方式，先點選Graphics > Representations > 將drawing method改為NewCartoon > Apply。

Step5. 點選Extensions > Modeling > Automatic PSF Builder > Load input files > Guess and split chains using current selections > I 'm feeling lucky 。接著會跑出1Y00_autopsf.psf的file。

Step6.  點選Extensions > modeling > Add Solvation Box > 打勾Rotate to minimize volume的選項 > Box Padding 設定Min: X=5, Y=5, Z=5 ；Max: X=15, Y=15, Z=15 > Solvate 。接著會跑出solvate.psf的file。在display的3D圖形中可以看到CsrA蛋白分子周圍被水分子包圍形成像box的分子模型。

Step7.  點選Extensions > Modeling > Add Ions > Iron placement mode的預先設定是使用NaCl做neutralize > Autoionize 。接著會出現ionized.psf的file 。

使用VMD的軟體經過以上步驟就可以完成在蛋白質分子的周圍加上水分子的應用囉!!!!!