分子生物專論期末作業

期末大驗收來囉!!!!!

<期末作業的內容:>

1. 請選出一個跟你論文主題相關的基因 (gene X)。

2. 將 gene X 於 Pubmed 或相關文獻探勘軟體，進行篇數，年代，作者趨勢分析。

3. 將 gene X 利用 NCBI Gene 入口，獲得相關序列資訊（包括 genomic, reference sequence, peptide sequence)

4. 利用 gene X 的序列進行 Blastn 或 Blastp，找出至少10條以上，20條以下，不同種 (species) 的序列，進行 Phylip 分析。使用方法為 NJ 與 ML。bootstrap 設定在 n = 250 。

5. 將 gene X 於 NCBI GEO profile 中尋找相關的表達資訊， 至少10個以上，20個以下。製成 tab txt file。再用 TMeV 畫出聚類分析圖形（至少三種）。

6. 將上述 5. 所得與 gene X 表達相關基因，利用 STRING 預測交互作用網路，並列出最有興趣的GO關係圖形 (CC, MF, BF) 三種。 

7. 預測 gene X 的蛋白結構圖。

8. 預測 gene X 的 micorRNA binding site。(因為我的研究是細菌，故沒有第8題喔)

以下為作業的整理:

1. 請選出一個跟你論文主題相關的基因 (gene x)

Carbon storage regulator A [Helicobacter pylori 26695]

我們實驗室主要是研究細菌的致病機轉，我的研究方向是幽門桿菌(H. pylori) CsrA蛋白對於調控游動能力的機轉。CsrA (Carbon storage regulator A)蛋白，是由幽門桿菌HP1442基因encode出來的protein。CsrA蛋白中文名稱為碳源調節蛋白，目前在E. coli的文獻已報導CsrA參與細菌醣類代謝、biofilm形成、motility的調控、quorum sensing、pathogenesis等。

2. 將 csrA gene於 Pubmed 或相關文獻探勘軟體，進行篇數，年代，作者趨勢分析。

用Pubmed搜尋幽門桿菌的CsrA基因，只有4篇文章發表。較少文獻發表也可以凸顯出我們做幽門桿菌CsrA研究的novelty。最早在2003年Journal of Microbiology報導CsrA會影響quorum sensing。接著分別在2004和2006年的Molecular microbiology報導CsrA作為global regulator調控的層面很廣，會影響virulence factor的表現，csrA mutant的菌株於mouse model的colonization能力也是顯著性下降。最新的2014發表的這篇則是出自於我們實驗室的研究，報導CsrA缺失是如何影響幽門桿菌游動能力和貼附感染細胞的能力。

3. 將 gene X 利用 NCBI Gene 入口，獲得相關序列資訊（包括 genomic, reference sequence, peptide sequence)

4. 利用 gene X 的序列進行 Blastn 或 Blastp，找出至少10條以上，20條以下，不同種 (species) 的序列，進行 Phylip 分析。使用方法為 NJ 與 ML。bootstrap 設定在 n = 250 。

我使用的是blastn，找到跟H. pylori 26695 csrA具有高度相似的其他序列，大部分都是H. pylori同種的細菌，還有找到其他species的菌。以下我選擇了10條序列進行親緣分析，先使用Bioedit的軟體整理序列。

接著將序列匯入"Phylip"軟體進行分析，最後以TreeViewX打開分析結果。跟H. pylori 26695親緣關係比較相近的是:同species是H. pylori J99 和 H. pylori 238。

5. 將 gene X 於 NCBI GEO profile 中尋找相關的表達資訊， 至少10個以上，20個以下。製成 tab txt file。再用 TMeV 畫出聚類分析圖形（至少三種）。

使用GEO Profiles搜尋CsrA( Helicobacter pylori) 發現的資料庫是針對酸刺激(low PH value)去看H. pylori基因表現量的改變。並沒有針對csrA基因影響下游基因機制的探討。因此無法找到相關的表達資訊。

6. 將上述 5. 所得與 gene X 表達相關基因，利用 STRING 預測交互作用網路，並列出最有興趣的GO關係圖形 (CC, MF, BF) 三種。
上述GEO profile沒有找到csrA調控的基因和network，在STRING的分析中輸入CsrA(選擇物種Helicobacter pylori 26695)。得到的結果CsrA蛋白大部分是跟游動能力和chemotaxis的protien進行interaction。例如其中一個交互作用的基因HP1032 (sigma factor 28)就是flagella biosynthesis的regulator。

7. 預測 gene X 的蛋白結構圖。

首先因為幽門桿菌的CsrA蛋白尚無解出結構，因此我使用homology modeling來進行結構的預測。我使用的工具是SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)。

輸入CsrA的胺基酸序列後，再以Pseudomonas fluorescens的CsrA (PDB number: 2JPP) 結構作為模板進行modeling。

最後就得到了H. pylori 26695 CsrA的蛋白的預測結構了!!!!!是一個dimer形式存在的protein~~~

最後要謝謝這堂課的主課老師和所有任課老師，這學期學到很多生資預測工具對我的研究幫助頗大。

以Multiple expriment viewer工具分析microarray data

Multiple experiment viewer(MeV)主要用來分析矩陣式的資料，例如microarray、96 well孔盤、RNA seq等。可將每個資料點做相關性分群，可比較實驗組、對照組之間的差異性，計算出基因與基因間的相關性。

步驟如以下:

1. 於moodle下載MeV的軟體以及老師給的microarray data，點選"TMEV.bat"進入MeV軟體頁面。點選File > Load data > Select file loader> Browse下載好的microarray data > Add all(依序時間點) > Load

2. Load microarray data後，會出現矩陣資料標示紅色與綠色。接著進行Normalization:

Adjust data > Normalization > Ratio Statistics > Confidence interval選擇95% > OK

Normalization的目的是讓數據之間可以互相比較的前處理，原始的數據不能直接比較。

3. 進行Normalization後可以先儲存檔案，接著要看基因與基因之間的相關性:

Analysis > Clustering > HCL: Hierarchical Clustering > 直接按OK

 4. 點選HCL Tree，可以看到基因與基因間的相關性。

5. 接著點選某一子範圍的tree來進行獨立分析:
先按子cluster的tree > 按右鍵 > Launch new session

6. 獨立某個子cluster的session後，進行Visualization分析各個基因之間的相關性。
Visualization > Gene Distance Matrix > genes > OK

7. 在Matrix View中，可以點選各點看基因與基因之間的關聯性。

8. 接著設定要分群的組數，將最接近的分成一組。

Analysis > Clustering > K-means/K-Medians > 選Cluster Genes > 設定Number of clusters 和 Maximum iterations  > OK

9. 在分群結果中，可以看到Cluster的圖型和表格，接著利用密度法(CAST)，依數據相關性自動分群，使用預設參數。
Analysis > Clustering > CAST 

10. 點選cluster的分析結果可以看到數據間的趨勢。

11. 最後在進行Normalization的步驟就完成了，可以讓基因之間的差異性更凸顯出來。分析的結果在all cluster中可以一起看到。

PyMol動畫製作

這次PyMol系列課程由王淑鶯老師主課，老師教我們先用RSCB data bank找出有興趣的蛋白，再用PyMol軟體立體繪圖及製作動畫。我主要研究的主題是幽門桿菌H. pylori 的CsrA蛋白，但是幽門桿菌的CsrA蛋白尚待結構發表，因此我選擇研究最為廣泛的大腸桿菌E. coli CsrA來做結構的探討。

1.首先先進入RSCB data bank的網頁(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do#Category-welcome)搜尋CsrA蛋白，選擇的species是E. coli 。

2. E.coli的CsrA蛋白代號是1Y00，可以看到右下角是CsrA蛋白的3D立體結構卡通圖。網站有整理出發表的文獻和作者解結構使用的方法是NMR。

3.簡單介紹一下CsrA蛋白，是一個RNA binding protein，結構為dimer form。蛋白2級結構為5個beta-sheet加1個alpha-helix。CsrA主要的角色是global regulator，在E.coli的model中已經廣泛被報導和細菌醣類代謝相關，更重要的是會影響細菌的virulence factor和pathogenesis，例如: motility. biofilm合成...等。

4.打開PyMol軟體，從Plugin → PDB Loader Service → 輸入1Y00，載入CsrA結構。

接著Hide everything>Show cartoon

5.改變結構的顏色，輸入指令: 

color gold, chain A>color red, chain B

從Display把background改成白色，按右鍵Ray讓圖像更清晰

按右下角的S可以顯示出序列

6.練習計算蛋白電性。

Action →  generate → vacuum electrostatics → protein contact potential (local)
(紅色: 負電 / 白色: 中性 / 藍色: 正電)

藍色的地方可能是CsrA結合目標RNA的binding sites。

7.最後製作CsrA蛋白360旋轉的動畫，指令如下:
 (1)定義動畫：mset 1 x120

 (2)設定旋轉360度的120個動畫:util.mroll 1,120,1
 (3)打開光線追蹤:set ray_trace_frames=1
 (4)將動畫動畫的圖片保存成編號的PNG檔案：mpng mov 

 (5)想要標定某個位置，先將原始圖存成F1>program>Y roll>8sec

 (6)標定想要呈現的位置，我標定的是CsrA的RNA binding site R44的位置

 label residue>將圖片存成F2>program>steady>2sec

 (7)將F1和F2的動畫圖片儲存PNG檔案

 (8)打開Movie Maker，將所有圖片匯入製成影片，每張圖片設定播放時間為0.05秒。

STRING於蛋白質交互作用的預測

STRING 9.1是免費線上網站，主要功能是以Network來呈現protein-protein interaction，其網址為http://string-db.org/

Step1. 進入STRING頁面，在搜尋protein name打上有興趣的蛋白名稱，我搜尋的是跟我研究有相關的CsrA蛋白，Organism選擇Helicobacter pylori 26695。點選GO!就會開始run data。

Step2. 在protein-protein interaction network中可以清楚看到與CsrA蛋白有交互作用的其他protein 。在input的表格中有簡單列出Predicted functional partners以及基因之間相關的score 。

STRING對於預測protein & protien interaction是很有用的工具。